Biopsja Cienkoigłowa FNA czy FNNA? Znaczenie aspiracji podczas cienkoigłowego pobierania materiału cytologicznego w onkologii weterynaryjnej

Cienkoigłowe pobieranie materiału do badania cytologicznego jest jedną z podstawowych procedur diagnostycznych w onkologii małych zwierząt. Wykorzystuje się je zarówno w diagnostyce zmian pierwotnych, jak i w ocenie regionalnych węzłów chłonnych, zmian narządowych oraz w stagingu nowotworów złośliwych.

Rutynowo stosowane są dwie techniki: fine-needle aspiration, FNA, w której podczas pobierania materiału wytwarzane jest podciśnienie, oraz fine-needle non-aspiration, FNNA/FNNAC, określana również jako technika kapilarna, w której materiał pobierany jest bez aktywnej aspiracji. Pozornie różnica jest niewielka. W praktyce wpływa jednak na sposób przemieszczania komórek i krwi do światła igły, a potencjalnie także na komórkowość próbki, hemodylucję, zachowanie morfologii komórek i odsetek materiałów diagnostycznych. Dostępne badania wskazują jednocześnie, że nie można uznać jednej z metod za optymalną niezależnie od pobieranego narządu.

Terminologia: FNA nie jest synonimem każdej „biopsji cienkoigłowej”

W praktyce klinicznej określenie fine-needle aspiration biopsy jest używane szeroko, jednak diagnostycznie bardziej precyzyjne jest mówienie o cienkoigłowym pobraniu materiału do cytologii. Zarówno FNA, jak i FNNA dostarczają głównie komórek pojedynczych i niewielkich agregatów komórkowych. W przeciwieństwie do core needle biopsy nie uzyskujemy reprezentatywnego walca tkanki z zachowaną architekturą histologiczną.

Ma to zasadnicze znaczenie w onkologii. Bardzo dobra jakość preparatu cytologicznego nie oznacza automatycznie, że cytologia zastępuje histopatologię. Dotyczy to szczególnie guzów mezenchymalnych, niektórych nowotworów o niskiej eksfoliacji, małych ognisk przerzutowych czy procesów limfoproliferacyjnych wymagających dalszego fenotypowania.

Technika FNA (biopsja aspiracyjna cienkoigłowa)

W klasycznej technice aspiracyjnej cienką igłę połączoną ze strzykawką wprowadza się do zmiany, a następnie poprzez cofnięcie tłoka wytwarza ujemne ciśnienie. Igła jest przemieszczana lub przekierowywana wewnątrz badanego obszaru, co powoduje mechaniczną dysocjację komórek oraz ich przemieszczanie do światła igły.

Trafiłam na ciekawe badanie Karakitsou i wsp. dotyczącym powierzchownych węzłów chłonnych u psów, tam stosowano igły 21 G, długości 1 cala, połączone ze strzykawką 5 ml. Węzeł był stabilizowany ręcznie. Igłę wprowadzano do jego wnętrza i raz przekierowywano bez całkowitego jej wycofania, uzyskując dwa przejścia przez tkankę. Próbkowano okolice korowe i rdzenne, a podciśnienie odpowiadające cofnięciu tłoka do około 2–3 ml stosowano okresowo przez kilka sekund. Istotnym elementem technicznym jest zwolnienie podciśnienia przed usunięciem igły z tkanki. Po pobraniu strzykawkę odłączano, napełniano powietrzem, ponownie łączono z igłą i materiał wydmuchiwano na szkiełko. Następnie wykonywano preparaty typu squash/pull-apart przy niewielkim nacisku.

Mechaniczna przewaga FNA polega na dodatkowym gradiencie ciśnienia sprzyjającym przemieszczaniu materiału do światła igły. Jednocześnie ten sam mechanizm może zwiększać napływ krwi po naruszeniu naczynia. W materiale z silnie unaczynionych tkanek potencjalnym efektem jest więc wzrost bezwzględnej ilości materiału, ale niekoniecznie wzrost liczby diagnostycznie użytecznych komórek względem liczby erytrocytów.

Technika FNNA (biopsja cienkoigłowa bez aspiracji)

W FNNA igła jest wprowadzana do zmiany bez podłączonej strzykawki i bez aktywnego generowania podciśnienia. Wykonuje się krótkie ruchy igłą i zmiany kierunku wewnątrz badanego obszaru. Mechaniczne przecięcie i oddzielenie komórek od tkanki oraz zjawiska kapilarne powodują gromadzenie materiału w świetle i nasadzie igły. Dopiero po zakończeniu pobierania igłę łączy się ze strzykawką wypełnioną powietrzem i materiał przenosi na szkiełko.

W eksperymencie Karakitsou techniki FNA i FNNA zostały maksymalnie ujednolicone. Podstawową zmienną eksperymentalną była obecność lub brak aspiracji. W FNNA podczas pobierania nie stosowano strzykawki; sposób wykonania preparatu był następnie taki sam jak w FNA.

Z punktu widzenia cytologii potencjalną zaletą FNNA jest ograniczenie hemodylucji. Potencjalną wadą pozostaje ryzyko uzyskania niewystarczającej liczby komórek w zmianach słabo eksfoliujących. Nie należy więc sprowadzać różnicy do hasła „FNNA jest delikatniejsza”. Efekt zależy od rodzaju tkanki, jej unaczynienia, kohezji komórek, liczby przejść, średnicy igły i techniki wykonania preparatu.

Powierzchowne węzły chłonne: badanie Karakitsou i wsp.

Karakitsou i wsp. przeprowadzili prospektywne badanie obejmujące 53 psy z klinicznym wskazaniem do cytologii węzłów chłonnych. U każdego zwierzęcia pobierano dwa palpacyjnie dostępne powierzchowne węzły chłonne. Jeden próbkowano metodą FNA, drugi FNNA. Kolejność technik randomizowano. Łącznie uzyskano materiał ze 106 węzłów.

Ocena obejmowała komórkowość, stopień hemodylucji, grubość preparatu, zachowanie komórek oraz liczbę fragmentów cytoplazmatycznych. Każdy parametr oceniano według wcześniej zdefiniowanej skali. Oceniający byli zaślepieni względem sposobu pobrania. Autorzy nie wykazali istotnych różnic między FNA i FNNA w żadnym z analizowanych parametrów jakości cytologicznej. Dotyczyło to zarówno całej populacji, jak i podgrupy psów z chłoniakiem.

Mediany dla całej populacji wynosiły między innymi 3 vs 3 dla komórkowości oraz 1,5 vs 1,5 dla kontaminacji krwią odpowiednio dla FNA i FNNA. Nie wykazano także różnic w zachowaniu komórek ani fragmentacji cytoplazmatycznej.

Odsetek próbek niediagnostycznych był identyczny: 3,8% dla obu metod. Przy FNA przyczyną były między innymi słaba konserwacja komórek, zbyt gruby preparat oraz hemodylucja z hipokomórkowością. W FNNA cztery materiały niediagnostyczne były nadmiernie hemodilucyjne i hipokomórkowe.

To ostatnie jest szczególnie interesujące. Brak aktywnej aspiracji nie eliminuje hemodylucji. Naczynie nadal może zostać uszkodzone mechanicznie przez igłę, a krew może dostać się do próbki niezależnie od wytwarzanego podciśnienia.

Chłoniak: brak wykazanej przewagi FNNA

W populacji Karakitsou znalazło się 14 psów z chłoniakiem wielkokomórkowym. Wszystkie 14 przypadków zostało prawidłowo rozpoznanych zarówno w materiale FNA, jak i FNNA.

Jest to klinicznie interesujące ze względu na podatność dużych komórek limfoidalnych na uszkodzenie podczas pobierania i przygotowywania rozmazu. Hipoteza, że wyeliminowanie podciśnienia będzie skutkować istotnie lepszym zachowaniem limfoblastów, nie została w tym badaniu potwierdzona. Nie można jednak rozszerzać tego wyniku na wszystkie chłoniaki.

Badana grupa obejmowała chłoniaki wielkokomórkowe, czyli nowotwory zazwyczaj bardzo dobrze eksfoliujące. Wyniki nie pozwalają wnioskować o przewadze lub równoważności technik w chłoniakach indolentnych, chłoniakach z małych komórek ani w bardziej subtelnych procesach limfoproliferacyjnych. To ważne ograniczenie kliniczne.

Fragmentacja komórek a flow cytometry

Autorzy oceniali również obecność lymphoglandular bodies, traktując fragmentację cytoplazmy jako potencjalny marker urazu komórkowego. Nie stwierdzili różnicy pomiędzy FNA i FNNA i parametr ten nie odpowiadał za niediagnostyczność badanych preparatów. Nie oznacza to jednak, że fragmentacja jest całkowicie bez znaczenia. Autorzy zwracają uwagę, że fragmenty cytoplazmatyczne komórek nowotworowych mogą utrudniać prawidłowe bramkowanie populacji w cytometrii przepływowej. Dla onkologa oznacza to, że kryterium „materiał wystarczył do cytologii” nie jest równoważne z kryterium „materiał jest optymalny do dalszej diagnostyki immunofenotypowej”.

Istotne ograniczenie projektu badania Karakitsou

Badanie ma ciekawy metodologicznie kompromis. FNA i FNNA nie wykonywano w tym samym węźle, lecz w dwóch różnych węzłach tego samego psa. Autorzy wybrali taki projekt celowo, ponieważ wcześniejsze dane sugerowały, że wykonanie jednej procedury przed drugą w tej samej tkance może wpływać na jakość drugiej próbki. Eliminuje to efekt wcześniejszego nakłucia, ale wprowadza inną zmienną: biologiczną heterogeniczność pomiędzy poszczególnymi węzłami. Ma to znaczenie zwłaszcza w stagingu nowotworów litych. Rozmieszczenie przerzutów może być ogniskowe, a dwa regionalne węzły tego samego zwierzęcia nie muszą mieć identycznego składu komórkowego.

Dlatego κ=0,84 należy interpretować jako bardzo dobrą zgodność kliniczną między procedurami zastosowanymi w tej populacji, a nie jako dowód analitycznej równoważności dwóch sposobów pobierania tego samego obszaru tkanki.

Inne badanie węzłów chłonnych dało inny wynik

Whitlock, Taeymans i Monti przeprowadzili randomizowane badanie 104 węzłów chłonnych psów i kotów pobieranych pod kontrolą ultrasonograficzną. W przeciwieństwie do badania Karakitsou każdy węzeł był próbkowany obiema technikami. FNA dawała istotnie częściej materiał diagnostyczny niż FNNA oraz charakteryzowała się większą komórkowością. Różnica była znamienna statystycznie dla obu parametrów, p=0,043. Nie wykazano natomiast istotnej różnicy w zachowaniu komórek ani hemodylucji. To badanie jest szczególnie ważne, ponieważ nie potwierdza prostej hipotezy „brak aspiracji = lepszy materiał”.

Różnica względem Karakitsou może wynikać między innymi z charakteru węzłów, populacji obejmującej psy i koty, pobierania pod kontrolą USG oraz zastosowania obu procedur w tym samym węźle. W praktyce oba badania prowadzą raczej do wniosku, że dla węzłów chłonnych nie ma silnych podstaw do rutynowego zastąpienia FNA techniką FNNA.

Śledziona: sytuacja zmienia się w silnie unaczynionej tkance

LeBlanc i wsp. porównali obie techniki podczas ultrasonograficznie kontrolowanego pobierania materiału ze śledziony u 24 psów i 7 kotów. FNNA dawała większą komórkowość (P=0,0002) i mniejszą kontaminację krwią (P=0,0023), przy braku różnicy w zachowaniu morfologii komórek.

W tym przypadku wynik ma również biologiczną spójność. W śledzionie, gdzie komponent krwi jest nieporównywalnie większy niż w typowym powierzchownym węźle chłonnym, dodatkowa aspiracja może zwiększać udział krwi w próbce bardziej niż liczbę diagnostycznie użytecznych komórek.

Nie należy jednak utożsamiać lepszej jakości preparatu z większą czułością diagnostyczną w rozpoznawaniu poszczególnych nowotworów śledziony. Badanie LeBlanc oceniało przede wszystkim parametry jakości materiału, a nie czułość cytologii wobec konkretnego rozpoznania histopatologicznego.

To rozróżnienie jest bardzo ważne w przypadku zmian śledzionowych.

Wątroba: większa diagnostyczność FNNA

Fleming i wsp. przeprowadzili prospektywne randomizowane badanie obejmujące 119 psów poddawanych ultrasonograficznie kontrolowanemu pobraniu materiału z wątroby. Zwierzęta randomizowano do FNA (n=54) lub FNNA (n=65).

Materiał diagnostyczny uzyskano u: 81,5% psów w grupie FNA i 93,9% psów w grupie FNNA.
Różnica była znamienna statystycznie, P=0,037.

Warto jednak przeczytać wyniki dokładniej niż samo zdanie końcowe abstraktu. Niediagnostyczne próbki były istotnie związane z małą komórkowością, gorszym zachowaniem komórek i silniejszą hemodylucją, ale częstość poszczególnych tych cech nie różniła się istotnie pomiędzy grupami FNA i FNNA. Najsilniejszym wynikiem badania jest więc wyższy całkowity odsetek materiałów diagnostycznych po FNNA, a nie jednoznaczne wykazanie poprawy każdego pojedynczego parametru cytologicznego. To rozróżnienie ma znaczenie przy interpretacji wyników i pokazuje, dlaczego samo czytanie wniosków autorów czasem bywa sportem ekstremalnym.

Średnica igły jest kolejną zmienną

Arai i wsp. porównali igły 22 G i 25 G podczas FNA zmian skórnych, podskórnych i wewnątrzjamowych u psów i kotów. Nie wykazano istotnej różnicy w komórkowości ani ogólnej możliwości postawienia rozpoznania. Próbki pobierane igłą 25 G zawierały mniej krwi, ale równocześnie wykazywały większy uraz komórkowy niż materiał uzyskiwany za pomocą 22 G.

Badanie przywołane przez Karakitsou wskazywało także na większy stopień urazu komórkowego przy zastosowaniu igieł długości 1,5 cala w porównaniu z igłami 1-calowymi. Z punktu widzenia praktyki pokazuje to, że jakość próbki jest wynikiem całego systemu pobrania, a nie pojedynczej decyzji „z aspiracją czy bez”.

Jakość materiału a staging węzłów chłonnych

W onkologii trzeba szczególnie uważać, aby nie wyciągnąć z badań FNA versus FNNA niewłaściwego wniosku. Jeżeli obie techniki dają wysokiej jakości materiał, nie oznacza to, że prawidłowy wynik cytologiczny wyklucza przerzut do węzła.

Ku, Kass i Christopher przeanalizowali 367 węzłów chłonnych psów i kotów, dla których dostępne były zarówno wyniki cytologii, jak i histopatologii. Dla rozpoznawania zmian nowotworowych cytologia osiągnęła czułość 66,6%, swoistość 91,5% i dokładność 77,2%. Szczególnie wysoki odsetek wyników fałszywie ujemnych obserwowano między innymi w przerzutach mięsaków oraz niektórych przerzutach mastocytoma.

Fournier i wsp. uzyskali podobnie pouczające wyniki w stagingu psów z nowotworami litymi. Czułość cytologii węzłów wynosiła 67% dla mięsaków, 100% dla raków, 63% dla czerniaków i 75% dla mastocytoma. Aż 25% aspiracji było niediagnostycznych, a spośród tych niediagnostycznych węzłów 20% zawierało przerzut w histopatologii. To klinicznie znacznie ważniejsza informacja niż niewielkie różnice pomiędzy FNA i FNNA.

Dobra cytologia nie usuwa problemu sampling error. Jeżeli przerzut obejmuje niewielki obszar węzła, możemy uzyskać perfekcyjny preparat cytologiczny z niewłaściwego fragmentu węzła.

Jak interpretować dostępne dane w onkologii?

Lokalizacja / sytuacja	FNA	FNNA	Interpretacja danych
Powierzchowne LN psa	bardzo dobra diagnostyczność	bardzo dobra diagnostyczność	Karakitsou: brak istotnych różnic
LN pod kontrolą USG, pies/kot	większa komórkowość i diagnostyczność	nieco gorsze wyniki	Whitlock: przewaga FNA
Chłoniak wielkokomórkowy	skuteczna	skuteczna	14/14 rozpoznań obiema metodami w Karakitsou
Śledziona	więcej krwi	większa komórkowość, mniej krwi	dane przemawiają za FNNA
Wątroba psa	81,5% próbek diagnostycznych	93,9% próbek diagnostycznych	przewaga FNNA w badaniu Fleming
Silnie unaczyniona zmiana	ryzyko hemodylucji	teoretyczna i częściowo udokumentowana korzyść	dobór zależny od tkanki
Mało komórkowa zmiana	aspiracja może zwiększyć yield	ryzyko materiału skąpokomórkowego	brak uniwersalnej reguły

Wnioski dla praktyki onkologicznej

Dane nie wspierają koncepcji jednej uniwersalnie najlepszej techniki cienkoigłowego pobierania materiału.

W przypadku powierzchownych węzłów chłonnych psa FNA i FNNA mogą dostarczać materiał o porównywalnej jakości, a u psów z chłoniakiem wielkokomórkowym nie wykazano diagnostycznej przewagi którejkolwiek metody. Jednocześnie randomizowane badanie węzłów próbkowanych pod kontrolą ultrasonografii wykazało większą komórkowość i większą częstość próbek diagnostycznych przy zastosowaniu aspiracji.

W przypadku śledziony i wątroby dostępne dane przemawiają silniej za techniką bez aspiracji, szczególnie ze względu na problem hemodylucji i odsetek materiałów diagnostycznych.

Najważniejszy wniosek dla onkologii jest jednak szerszy: optymalizacja cytologii nie kończy się na wyborze FNA lub FNNA. Diagnostyczność zależy od wyboru właściwej zmiany i właściwego obszaru zmiany, liczby i kierunku pobrań, średnicy i długości igły, sposobu przygotowania preparatu, doświadczenia operatora oraz biologii samego nowotworu.

A w stagingu węzłowym pozostaje jeszcze jedna warstwa problemu: wynik ujemny cytologicznie może wynikać nie z niewłaściwej techniki FNA/FNNA, lecz z przestrzennej heterogeniczności przerzutu i pobrania materiału z obszaru niezajętego przez nowotwór. W określonych sytuacjach histopatologia węzła pozostaje więc metodą bardziej wiarygodną niż nawet technicznie doskonałe pobranie cytologiczne.

Piśmiennictwo

1. Karakitsou V, Christopher MM, Meletis E, et al. A comparison of cytologic quality in fine-needle specimens obtained with and without aspiration from superficial lymph nodes in the dog. J Small Anim Pract. 2022;63:16–21. DOI: 10.1111/jsap.13429.
2. Whitlock J, Taeymans O, Monti P. A comparison of cytological quality between fine-needle aspiration and non-aspiration techniques for obtaining ultrasound-guided samples from canine and feline lymph nodes. Vet Rec. 2021;188:e25.
3. LeBlanc CJ, Head LL, Fry MM. Comparison of aspiration and nonaspiration techniques for obtaining cytologic samples from the canine and feline spleen. Vet Clin Pathol. 2009;38:242–246.
4. Fleming KL, Howells EJ, Villiers EJ, Maddox TW. A randomised controlled comparison of aspiration and non-aspiration fine-needle techniques for obtaining ultrasound-guided cytological samples from canine livers. Vet J. 2019;252:105372.
5. Arai S, Rist P, Clancey N, et al. Fine-needle aspiration of cutaneous, subcutaneous, and intracavitary masses in dogs and cats using 22- vs 25-gauge needles. Vet Clin Pathol. 2019;48:287–292.
6. Ku CK, Kass PH, Christopher MM. Cytologic-histologic concordance in the diagnosis of neoplasia in canine and feline lymph nodes: a retrospective study of 367 cases. Vet Comp Oncol. 2017;15:1206–1217.
7. Fournier Q, Cazzini P, Bavcar S, et al. Investigation of the utility of lymph node fine-needle aspiration cytology for the staging of malignant solid tumors in dogs. Vet Clin Pathol. 2018;47:489–500.